默克生命科学｜验证成功的基因打靶，为基因编辑实验选择合适的对照品对于确定结果的有效性和排除故障至关重要。CRISPR有许多不同类型的控件。至少，每个CRISPR实验都应该有阳性和阴性对照。
有许多选择可用来衡量基因编辑实验的成功，包括Sanger测序、错配检测分析、下一代测序（NGS）、表型评估以及测量目标基因的mRNA和蛋白质水平。这些方法在灵敏度、可扩展性、分辨率和成本方面有所不同。
例如，尽管NGS提供了极高的灵敏度和分辨率，但成本高昂，并且需要大量的技术专业知识来执行。另一方面，错配检测易于进行，但缺乏Sanger测序和NGS的灵敏度。
确定indel的存在通常被认为是最佳实践。然而，仅仅测量基因组的变化并不足以确定它们是否破坏了基因功能并产生了导致表型反应的基因敲除。测量蛋白质水平也很重要，最好使用经过充分验证的抗体。
下一代测序
下一代测序（NGS）不需要建立含有突变的克隆细胞群，并识别细胞亚群中的罕见突变。高错误率和每次运行的成本是当前这种验证技术的主要障碍。测序技术的不断进步和成本的下降意味着NGS将很快成为CRISPR编辑的主要验证选择。
Surveyor核酸酶分析
Surveyor核酸酶分析是一种基于错配检测原理的简单方法。在这种方法中，来自编辑过的等位基因的PCR产物池被变性和再杂交，之后Surveyor核酸酶选择性地检测和切割那些由于在细胞NHEJ修复过程引入的一条链上存在indel而错配的配对。在琼脂糖凝胶上检测结合错配的切割的DNA扩增子。这种分析的分辨率有限，因为它会遗漏小的内含子，并且无法区分CRISPR衍生的内含子和自然发生的多态性。
TIDE测定
通过分解追踪indel（TIDE）提供了一种更灵敏的indel检测方法。该方法包括：
从转染细胞分离的DNA中扩增核酸酶靶向的基因组区域。
Sanger测序PCR产物。
测序分析以确定indels的存在
TIDE降低了验证的总成本，因为它允许Sanger测序在混合细胞群上进行。然而，这种混合的方法意味着它不能区分两个相同长度的等位基因，并且它与罕见的等位基因斗争。此外，TIDE的可靠性取决于PCR产物和Sanger测序的质量。
正交验证的重要性
虽然基因编辑实验成功的技术验证至关重要，但它不能识别假阳性和假阴性，无论编辑是否导致了所需的表型，也不能保证所识别的基因是有用的治疗靶点。
它们也是相对简单的检测方法，不能传达在许多疾病中观察到的突变和转录失调的复杂性质，也不能知道小分子或蛋白质介导的抑制是否会在体内产生相同的反应。
因此，实施CRISPR敲除实验应辅以更细致的功能增益分析，包括CRISPR敲入和CRISPR激活。
验证成功的基因打靶
基因打靶成功的确认需要检测CRISPR实验引入的插入或缺失（indels）。
SangerDNA测序
DNA测序是一种可靠和高度敏感的方法，可以准确识别引入的突变。这种方法被认为是基因编辑验证的金标准，尽管该技术耗时耗力，在测序前需要多个准备步骤来建立克隆细胞群。
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