高效液相色谱法是制药、食品、环境等行业中应用最为广泛的分析技术，具有分离效率高，选择性好，灵敏度高等优点。目前，色谱柱填料纯度和种类、色谱柱规格及填充工艺均日益改进，为分析工作者提供了丰富的选择。同时，流动相的选择包括有机相的种类、混合比例、添加剂和pH值等，选择合适的流动相对于液相色谱的分析至关重要。流动相通常是由水和有机溶剂(如：乙腈、甲醇等)组成的混合溶液，一般可通过添加三乙胺、乙酸铵、甲酸、乙酸、三氟乙酸等来提高分离度或改善色谱峰形。因此，在高效液相色谱分析方法开发过程中，固定相和流动相的选择是实现良好分离效果的关键之一。
在分析方法开发或使用过程中，流动相添加剂选择或使用不当，不仅会导致分离效果不达预期，甚至可能导致色谱柱或仪器的损坏，因此，流动相、添加剂、离子对试剂等的正确选择是色谱分析的重中之重。比如：在药物分析时，由于大多数药物是可电离的，即酸性、碱性或两性离子。一般情况下需要通过加入pH调节剂、缓冲盐等添加剂，抑制样品组分解离或与待测组分“结合”，从而实现组分合理保留并获得良好峰型的目的。常见的流动相添加剂包括：磷酸盐缓冲液、铵盐缓冲液、三氟乙酸、三乙胺、离子对试剂等。
离子对试剂应用简介
离子对试剂主要用于液相色谱法分析中，当样品电离能力较强时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留。这时需要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子，从而将其留住。离子对试剂主要用于提高高效液相色谱的分离效果。当使用液相色谱法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂。离子对的疏水性越强，其在反相固定相上的保留越大，从而达到样品分离的目的。
以离子对试剂在强碱性/强酸性化合物分离中的应用为例：分析物为强碱性化合物，通常会在流动相中添加烷基磺酸盐离子对试剂，如：戊烷磺酸钠等；分析物为强酸性化合物，通常流动相中会添加四烷基铵盐或烷烃铵盐离子对试剂，如：四丁基溴化铵等，经过长时间的色谱柱平衡，流动相中离子对试剂的疏水端（烷基部分），与固定相长链强力吸引；亲水端（磺酸阴离子或氮正离子）则暴露于固定相与流动相的相界面上。当被分析离子化合物进入色谱柱时，强碱性化合物/强酸性化合物与相界面上的磺酸阴离子/氮正离子产生静电作用，从而产生保留。
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离子对试剂的使用小窍门
当使用的离子对试剂疏水性较强（如：烷基磺酸盐）或季铵盐试剂（如：四丁基铵）时，柱平衡通常较慢，需要注意基线稳定性和保留值重现性。
若发现选择的离子对试剂不合适而想换一种离子对试剂时，如果不更换色谱柱，最好先充分清洗掉原来色谱柱中的离子对试剂，再用新流动相平衡色谱柱。不同的离子对试剂有不同的清洗方法，通常建议如下：
· 对于阴离子试剂：建议使用50%~80%的甲醇-水清洗；
· 对于季铵盐类试剂：建议使用50%甲醇-缓冲剂清洗，其中加入磷酸钾的目的是降低试剂铵基与硅羟基发生作用。
离子对试剂对色谱柱的影响：如果使用的离子对试剂疏水性非常强，那么它会在固定相上产生持久的保留，对色谱柱产生不可逆的的改性。因此需要专柱专用，特别在开发新色谱方法的时候，不要使用这种被改性过的色谱柱。
某些情况下需要严格控制流动相的pH和柱温，另外，对于要加入挥发性离子对试剂的流动相，配制时建议在溶剂液面以下放液，避免出现重现性问题。
使用离子对试剂的流动相条件，有时会观察到同时出现正峰和负峰的现象，这些峰会干扰建立方法或者日常检测，这类问题主要原因是使用纯度不高的离子对试剂、缓冲盐或者其他其他流动相添加剂等。另外，不纯的离子对试剂，也影响分析物的保留时间。
使用含离子对试剂的流动相，特别是疏水性较强的离子对试剂，柱平衡缓慢，如果平衡时间不够，会出现保留时间漂，结果不稳定的情况，一般建议含离子对试剂的流动相采用等度洗脱条件，因为走梯度，易出现基线波动和保留重现性问题，为保证色谱柱达到较好的平衡状态，使用前最好能小流速过夜平衡。
较弱的离子对试剂，如：三氟乙酸、五氟丙酸酐等，这些试剂不会减慢柱平衡过程，通常用流动相平衡10-20倍柱体积就足以达到平衡。当样品中同时含有酸性和碱性化合物时，这两种离子对试剂都可能有效，但我们不能把这两种试剂都添加到流动相中，这些试剂之间有形成离子对的趋势，会抵消它们对分离的净效应，而且同时使用两种试剂还会使方法建立变得更为复杂。
当需要有选择性地增加碱性溶质的保留时，首选的离子对试剂应是烷基磺酸盐，而四烷基铵盐则在需要增加酸性溶质的保留时应用。
通过调节流动相，解决碱性化合物的色谱峰拖尾现象
选择正确的离子对试剂
使用离子对试剂可以增强碱性化合物的保留，改善碱性化合物峰形。适合碱性化合物的离子对试剂主要有：庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠、十二烷基烷磺酸钠等。在酸性条件下，碱性化合物的阳离子会和烷基磺酸根阴离子形成中性离子对，使碱性化合物变成中性化合物，并增强疏水性。
使用三乙胺或二乙胺
当我们发现碱性化合的峰形出现拖尾时，在流动相里添加1%的三乙胺，再用磷酸把流动相调回酸性。在酸性条件下，三乙胺阳离子和键合相中游离的硅羟基结合，占据键合相中所有与碱性化合物作用的活性中心，屏蔽碱性化合物的二级作用，从而改善峰形。其中二乙胺相比三乙胺，沸点更低，更加适合LC-MS质谱检测。
调整流动相pH值
对碱性化合物来说，流动相的pH不仅仅对峰形，还对保留因子和选择性都有很大影响。一般来建议碱性化合物的流动相 pH≤2.5，会有比较好的峰形。
选择高纯度的缓冲盐
让流动相维持在一个相对稳定的pH条件下；同时增加流动相足够的离子强度。高浓度缓冲盐中金属离子“包裹”游离硅羟基，并呈正电状态，阻断碱性化合物与固定相的二级反应，减小拖尾，改善峰形。缓冲盐的弱酸根（阴离子）作用是维持流动相体系在一个稳定的pH环境，提高方法重现性。同时，在选择缓冲盐/添加剂时要确保缓冲盐和添加剂与固定相兼容。
常用离子对试剂、缓冲盐、改进剂等
LiChropur™离子对试剂产品特色
✅ 纯度可达99%以上：易形成稳定的离子对，提高待测样品的分离度和重现性；
✅ 低紫外吸收：250 nm下紫外透光率≥98%；200 nm下紫外透光率≥70%，提高检测灵敏度，有效减少流动相在紫外检测器中的吸收，从而降低背景噪音；
✅ 低水分含量、良好的化学稳定性：不会与流动相发生反应，适用于不同的流动相组合和检测条件；
✅ 溶解性高：可在流动相中均匀分布，以便获得一致性的分离效果，避免堵塞色谱柱或有盐类析出导致清洗困难等；
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